Isolierung und Charakterisierung proteinogener BPTI-Liganden und deren Potential zur nachträglichen chemischen Modifikation

Neben der eigentlichen Produktion rekombinanter Proteine spielt zusätzlich deren Aufreinigung für die Qualität des biotechnologischen Produktes eine zentrale Rolle. Konventionell eingesetzte Methoden des Downstream-Prozesses basieren meist auf Liganden, die das Target spezifisch binden und unter denaturierenden Bedingung wieder entlassen. Motiviert von der Idee, solch eine Interaktion photoinduktiv zu kontrollieren, sollte eine Basis in Form von verschiedenen Interaktionspartnern für ein vorgegebenes Target geschaffen werden, die ein hohes Potential zur chemischen Veränderung bieten ohne die vorhandenen Bindungseigenschaften zu zerstören. Mittels Phage Display wurde für das Zielprotein BPTI zunächst ein Interaktionspartner bestehend aus 20 Aminosäuren aus einer linearen Peptidbibliothek isoliert. Nach Charakterisierung der Bindungseigenschaften wurde die korrelierende Dissoziationskonstante mit 1,6 μM beziffert. Nach der Synthese terminal verkürzter Abkömmlinge konnte ein starker Einfluss der beiden Enden in die Interaktion festgestellt werden. Eine chemische Modifikation wie der Einbau einer Azobenzolaminosäure sollte daher im mittleren Teil der Sequenz erfolgen. Liganden im Antikörperformat binden das Zielmolekül meist mit höherer Affinität und Spezifität, sind aber in der Herstellung so aufwendig und teuer, dass sie im Produktionsmaßstab zur Aufreinigung kaum Anwendung finden. Daher wurde nach Isolierung von BPTI-bindenden Antikörperfragmenten im scFv (single chain fragment variable)-Format versucht, die interagierende Region als Mimotop abzubilden. Durch die kovalente Verknüpfung der complementarity determinig Regions der schweren und leichten Immunglobulinkette über einen Linker konnten ebenfalls lineare Peptide synthetisiert werden. Bindungsstudien der so entstandenen Makromoleküle zeigten mit KD-Werten von 515 nM bzw. 164 nM eine stärkere Bindung an das Zielmolekül. Zudem bietet der in die Interaktion nicht involvierte Linker eine ideale Region zur chemischen Modifikation, die beispielsweise eine Photomodulation der Interaktion ermöglichen könnte.