Aktivierung, Bindung und Umsetzung von Desoxynukleosid-5'- Monophosphaten in Oligonukleotidkomplexen

More about the book

In dieser Arbeit wurden chemische Primerverlängerungsreaktionen und die Bindungseigenschaften von Mononukleotiden in Oligonukleotidkomplexen untersucht. Bei der chemischen Primerverlängerung wird ein auf einem DNA-Templat gebundenes Oligonukleotid in Abwesenheit einer Polymerase um das komplementäre Nukleotid verlängert. Diese Reaktionen, die Schritte der DNA-Replikation nachahmen, können mit Aktivestern von Nukleosid-5'-monophosphaten induziert werden. Die Untersuchungen zur Beschleunigung der enzymfreien Primerverlängerungsreaktion zeigten, dass die Zugabe von Heterozyklen die Reaktion beschleunigte. Insbesondere Pyridin, das als kovalenter Katalysator wirkt, erhöhte die Geschwindigkeit der Primerverlängerung um den Faktor sieben, sodass Halbwertszeiten von weniger als einer Minute erreicht wurden. Zudem konnten enzymfreie Primerverlängerungsreaktionen bei submillimolaren Monomerkonzentrationen durchgeführt werden, indem Reaktionsbedingungen entwickelt wurden, die eine in situ Aktivierung der Desoxynukleosid-5'-monophosphate ermöglichten. Eine Kombination von Carbodiimid EDC und 1-Methylimidazol führte zu einem vollständigen Umsatz des Primers bei 0,5 mM Monomerkonzentration. Darüber hinaus wird das Binden von Mononukleotiden an Oligonukleotid-Tripelhelices beschrieben, die eine Einzelnukleotidlücke im zentralen Strang enthalten. Die entworfenen Monomer-Liganden zeigen eine hochaffine und basenspezifische Bindung, was durch